Six mois après les événements d’Underworld 2 : Évolution, les humains ont découvert l'existence des vampires et des lycans et tentent de les exterminer. Selene est capturée par les humains. Elle se réveille en plein milieu d'un laboratoire appelé « Antigen » après avoir été plongée dans un coma artificiel pendant douze ans. Elle découvre que le monde qu'elle connaissait a bien changé pendant ce temps, mais garde espoir de retrouver Michael.
Selene rencontre Eve, une jeune adolescente qui se révèle non seulement être un hybride des deux espèces, mais également sa fille. Selene et Eve trouvent refuge auprès d'un groupe de vampires dont fait partie David. Rapidement, le refuge est attaqué par un groupe de lycans mené par un nouveau genre de loup-garou, plus grand, plus fort et insensible à l'argent. Thomas, chef du groupe et père de David, leur livre Eve quand Selene est vaincue.
Selene en est persuadée : les lycans n'ont pas disparu ; ils préparent leur retour grâce à Antigen, et ils ont besoin d'Eve pour cela. En effet, le plan du docteur Jacob Lane est d'utiliser les ovules d'Eve pour engendrer des clones de lycans bénéficiant des effets du vaccin développés avec le sang d'Eve. Partie à la recherche de sa fille Selene s'aperçoit que Michael est toujours vivant, plongé lui aussi dans un coma artificiel. Avec l'inspecteur Sebastian elle contre-attaque et réussit à libérer Eve, celle-ci affronte Jacob et finit par le tuer. Quant à Selene, elle sort victorieuse de son duel avec le grand lycan. D'après les dires d'Eve, Michael se serait échappé par le toit du laboratoire, en s'y rendant Selene, David et Eve finissent par constater que celui-ci a disparu.
